免疫熒光技術(shù)直接法測抗原實(shí)驗(yàn)步驟

⑴基本原理

將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上,直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。其優(yōu)點(diǎn)是方法簡便、特異性高,非特異性熒光染色少。缺點(diǎn)是敏感性偏低;而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。此法常用于細(xì)菌、病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢、皮膚活檢的免疫病理檢查。

⑵試劑與儀器

磷酸鹽緩沖鹽水(PBS):0.01mol/L,pH7.4

熒光標(biāo)記的抗體溶液:以0.01mol/L,pH7.4的PBS進(jìn)行稀釋

緩沖甘油:分析純無熒光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸鹽緩沖液1份配制

搪瓷桶三只(內(nèi)有0.01mol/L,pH7.4的PBS 1500ml)

有蓋搪瓷盒一只(內(nèi)鋪一層浸濕的紗布?jí)|)

熒光顯微鏡

玻片架

濾紙

37℃溫箱等。

⑶實(shí)驗(yàn)步驟

① 滴加0.01mol/L,pH7.4的PBS于待檢標(biāo)本片上,10min后棄去,使標(biāo)本保持一定濕度。

② 滴加適當(dāng)稀釋的熒光標(biāo)記的抗體溶液,使其wan全覆蓋標(biāo)本,置于有蓋搪瓷盒內(nèi),保溫一定時(shí)間(參考:30min)。

③ 取出玻片,置玻片架上,先用0.01mol/L,pH7.4的PBS沖洗后,再按順序過0.01mol/L,pH7.4的PBS三缸浸泡,每缸3-5 min,不時(shí)振蕩。

④ 取出玻片,用濾紙吸去多余水分,但不使標(biāo)本干燥,加一滴緩沖甘油,以蓋玻片覆蓋。

⑤ 立即用熒光顯微鏡觀察。觀察標(biāo)本的特異性熒光強(qiáng)度,一般可用“+"表示:

(-)無熒光;(±)極弱的可疑熒光;(+)熒光較弱,但清楚可見;(++)熒光明亮;(+++ --++++)熒光閃亮。待檢標(biāo)本特異性熒光染色強(qiáng)度達(dá)“++"以上,而各種對(duì)照顯示為(±)或(-),即可判定為陽性。

⑷注意事項(xiàng)

1)對(duì)熒光標(biāo)記的抗體的稀釋,要保證抗體的蛋白有一定的濃度,一般稀釋度不應(yīng)超過1:20,抗體濃度過低,會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生的熒光過弱,影響結(jié)果的觀察。

2)染色的溫度和時(shí)間需要根據(jù)各種不同的標(biāo)本及抗原而變化,染色時(shí)間可以從10 min到數(shù)小時(shí),一般30 min已足夠。染色溫度多采用室溫(25℃左右),高于37℃可加強(qiáng)染色效果,但對(duì)不耐熱的抗原(如流行性乙型腦炎病毒)可采用0-2℃的低溫,延長染色時(shí)間。低溫染色過夜較37℃30 min效果好的多。

3)為了保證熒光染色的正確性,shou次試驗(yàn)時(shí)需設(shè)置下述對(duì)照,以排除某些非特異性熒光染色的干擾。

① 標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照:標(biāo)本加1-2滴0.01mol/L,pH7.4的PBS。

② 特異性對(duì)照(抑制試驗(yàn)):標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體,再加熒光標(biāo)記的特異性抗體。

③ 陽性對(duì)照:已知的陽性標(biāo)本加熒光標(biāo)記的特異性抗體。

如果標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照和特異性對(duì)照呈無熒光或弱熒光,陽性對(duì)照和待檢標(biāo)本呈強(qiáng)熒光,則為特異性陽性染色。

4)一般標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過3min,就有熒光減弱現(xiàn)象,經(jīng)熒光染色的標(biāo)本最好在當(dāng)天觀察,隨著時(shí)間的延長,熒光強(qiáng)度會(huì)逐漸下降。